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Protocollo di Estrazione del DNA (salting out) STRUMENTAZIONE E MATERIALE OCCORRENTE:

  • micropipette
  • centrifuga
  • stufa termostatica
  • vortex
  • congelatore (-20°C)
  • microprovette da 1,5 ml
  • NaCl 6M
  • proteinasi k
  • etanolo 100%
  • etanolo 70%
  • acqua
  • pk buffer

DESCRIZIONE: l’estrazione del DNA con il metodo salting out, messo a punto da Aljanabi e Martinez nel 1997, è una procedura efficiente ed economica che utilizza reagenti non tossici. Il protocollo prevede l’aggiunta di sali per modificare la solubilità delle proteine (gli ioni salini attraggono l’acqua, interagendo di meno con le proteine): in tal modo le proteine precipitano ed è favorito il loro allontanamento dalla soluzione acquosa in cui è presente il DNA.

PROCEDIMENTO:

  1. Tagliare un pezzo di campione ed inserirlo in una provetta eppendorf da 1,5 ml, aggiungere:300 μl di Pk buffer + SDS, 10 μl di proteinasi K (concentrazione iniziale 20mg/ml) Agitare (Vortex) oppure centrifugare rapidamente.
  2. Mettere le eppendorf nel Thermoblock a 56 C° e 850 rpm per 2 ore (si può usare anche alternativamente il bagno maria oppure stufa termostatica alla stessa temperatura provvedendo ad agitare le provette di tanto in tanto .
  3. Aggiungere 100μl di NaCl 6M.
  4. Agitare (vortex) ogni campione per 15 s.
  5. Centrifugare per 18 min a 13.200 giri. Questa operazione permette di isolare sul fondo della provetta una fase organica contenente le proteine ed una fase acquosa in superficie, contenente il DNA (Fig. 1)
  6. Togliere il sopranatante contenente il DNA e trasferirlo in un’altra provetta eppendorf.
  7. Aggiungere 1 ml di etanolo 100% e mescolare capovolgendo la provetta più volte.
  8. Mettere in freezer (-20 C°) per almeno 2 ore.
  9. Centrifugare a 13.200 giri per 15 min a 4 C°.
  10. Rimuovere il sopranatante e aggiungere 300μl di etanolo 70%, agitare a braccio e centrifugare per 15 min.
  11. Ripetere il lavaggio per altre 2 volte.
  12. Rimuovere il sopranatante e lasciare asciugare il pellet.
  13. Aggiungere 30μl di acqua pura (DNAse free) e lasciare sospendere mettendo l’eppendorf a +4 per una notte.

1ml 50 ml Concentrazione finale

EDTA 0,5M 20μl 1ml 10 mM
TRIS 1M 100μl 5ml 100ml
ph8,0
SDS 20%(liquida) 100μl 5ml2%
H2O Sigma 780μl 39ml

playground/playground.txt · Ultima modifica: 2019/09/23 14:30 (modifica esterna)