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biologia:esperienze_possibili:verifica_estrazione_su_gel

Verifica dell’estrazione del DNA mediante elettroforesi

E’ possibile verificare l’avvenuta estrazione del DNA tramite l’elettroforesi utilizzando come supporto un gel di agarosio.

Materiali utilizzati:

  • Cilindro graduato
  • 1 becker o una beuta da 100 ml
  • Bilancia
  • Microonde (o in alternativa bagnomaria o stufa termostatica)
  • Micropipetta
  • Agarosio
  • TBE
  • Safe View
  • Loading dye
  • DNA marker
  • Acqua distillata
  • Camera elettroforetica
  • Alimenrìtatore
  • transilluminatore
TBE 1X 1L
Trizma base 10,8 g
Acido borico 5,5 g
EDTA 0,744 g oppure 40 ml EDTA 0.5 pH 8.3
Acqua distillata Porta a volume finale
  1. Preparare il gel di Agarosio 1% sciogliendo (in un becker o in una beuta) 1 gr di agarosio in polvere in 100ml di TBE1X all’interno di un microonde (in alternativa si può utilizzare il bagnomaria o una stufa termostatica; in questo caso sarà richiesto un tempo maggiore).
  2. Una volta sciolto aggiungere 5 ul di Safe View e agitare brevemente.
  3. Versare il liquido in una vaschetta da elettroforesi precedentemente chiusa ed a cui sono stati aggiunti pettini per creare pozzetti. Versare il liquido lateralmente cercando di non formare bolle ed di non superare con il liquido l’altezza del pettine. Aspettare quindi che il gel solidifichi a temperatura ambiente (solitamente sono sufficienti 15 minuti. immagine7.jpg immagine8.jpg
  4. Posizionare la vaschetta con all’interno il gel all’interno della cameretta elettroforetica; versare nella cameretta il TBE 1x fino a sommergere il gel, a questo punto rimuovere il pettine.
  5. Caricare i campioni di DNA dei singoli pozzetti:
    • stendere un pezzo di parafilm sul banco di lavoro in modo da posizionarvi sopra, ben separate, le gocce di campione da caricare. Per per ogni campione il volume da cariacre è costituito da 2 ul di Loading dye e 10 ul di soluzione acquosa contenente il DNA estratto ( il Loading dye è concentrato 6x quindi va diluito assieme al campione).
    • Caricare ogni campione all’interno di uno dei pozzetti del gel. Fare attenzione: posizionarsi con la punta della micropipetta all’interno del pozzetto ma non troppo infondo in modo da non bucare il pozzetto.
  6. Dopo aver caricaro tutti i campioni chiudere il coperchio della camera elettroforetica, collegarla con i cavi all’alimentatore e dopo aver acceso far correre i campioni a 90 Volts per circa 15 m.
  7. Terminato il tempo di corsa è possibile verificare la presenza delle bande di DNA posizionando il gel su trans illuminatore. La velocità di “corsa” delle bande e dunque la loro distanza dai pozzetti è inversamente proporzionale alle loro dimensioni.
biologia/esperienze_possibili/verifica_estrazione_su_gel.txt · Ultima modifica: 2019/09/23 14:30 (modifica esterna)