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biologia:esperienze_possibili:sequenziamento_dna

Sequenziamento DNA

Il sequenziamento è una tecnica utilizzata per determinare la sequenza nucleotidica, ovvero la successione esatta dei nucleotidi di una specifica regione di DNA. Si possono determinare le sequenze regolatrici (ovvero promotori e terminatori) e quelle codificanti (che vengono espresse in proteine). Una metodica del sequenziamento molto utilizzata è quella messa a punto dal chimico Frederick Sanger nel 1977, ed è conosciuta come metodo Sanger o “a terminazione di catena”. Nel metodo Sanger si utilizzano dideossinucleosidi trifosfati marcati radioattivamente o con fluorescenza (detti ddNTP) privi del gruppo ossidrilico dello zucchero in posizione 3’, detti terminatori di catena. In particolare, quando si usa il metodo di Sanger sono necessari:

  • DNA polimerasi (enzima in grado di sintetizzare un nuovo filamento di DNA a partire da un oligonucleotide cioè da un primer)
  • Primer
  • Desossiribonucleotidi trifosfato (dNTP) che trasportano le basi azotate A,T,C,G
  • ddNTP

I nucleotidi o il primer devono essere marcati (di solito per fluorescenza). Si prende in esame una porzione di DNA di interesse e la si amplifica attraverso PCR. Si susseguono una serie di fasi:

  • a) denaturazione della doppia elica
  • b) appaiamento del primer, che si lega alla sequenza complementare sul filamento di DNA stampo;
  • c) legame della DNA polimerasi al primer e inizio della sintesi del nuovo filamento, con aggiunta dei nucleotidi sia marcati che non, rispettando la regola di complementarietà.

Una volta inserito il nucleotide modificato la sintesi si arresta e la DNA polimerasi si stacca; questo perché il nucleotide marcato non possiede il gruppo ossidrile in posizione 3’, impedendo così la formazione del legame fosfodiesterico con un successivo nucleotide. A questo punto inizia un secondo ciclo partendo dalla denaturazione del doppio filamento DNA stampo-DNA con nucleotidi modificati e segue gli stessi passaggi descritti precedentemente, continuando per un numero tot di cicli. Alla fine si ottengono frammenti di DNA di varia lunghezza, che differiscono per il tipo di ddNTP con il quale terminano. Questa miscela di frammenti viene caricata su gel di poliacrillammide-urea e sottoposta ad elettroforesi. Durante l’elettroforesi viene applicata una carica elettrica che provoca lo spostamento dei filamenti di DNA dal polo negativo verso il polo positivo. I filamenti più corti migrano molto più velocemente rispetto a quelli più lunghi, e in questo modo è possibile ordinare i frammenti in base alla loro lunghezza. Il sistema è molto sensibile e permette la separazione dei frammenti che differiscono per un solo nucleotide.

E’ possibile utilizzare dei ddNTP legati a molecole fluorescenti. Tramite un laser che eccita i fluorocromi, ciascuno dei quali emette una lunghezza d'onda caratteristica per ogni base ( A T C G ), ogni ddNTP è associato a un colore diverso ed il raggio laser permette di stabilire l’identità del nucleotide via via che viene inserito nel filamento sintetizzato dalla PCR (approfondimenti nella scheda:Amplificazione DNA). Il risultato è un cromatogramma, una sequenza di picchi di quattro colori diversi uno per ogni nucleotide. Con questa tecnica è possibile sequenziare circa 1000 nucleotidi, dato che per determinare una sequenza più lunga bisogna frammentarla attraverso enzimi di restrizione. Il metodo di Sanger ha permesso di sequenziare il Genoma Umano ma anche quello di molti altri organismi. Esistono ad oggi diversi metodi per il sequenziamento, più veloci e con costi più accessibili, ma molti si basano ancora sul metodo Sanger. Negli ultimi 15 anni la ricerca in questo campo ha avuto un grande impulso e sono state utilizzate diverse strategie da applicare nell’ottimizzazione del sequenziamento. Tra queste lo sviluppo dei metodi di Next Generation Sequencing ( NGS), che permettono il sequenziamento di grandi genomi in un tempo breve. Le metodiche di NGS hanno portato alla riduzione dei tempi della diagnosi molecolare di malattie genetiche, e hanno permesso l’applicazione di questi approcci anche in molti campi della biologia.

Nel nostro progetto, abbiamo identificato campioni di insetti su base morfologica, ed in seguito abbiamo amplificato il frammento del DNA mitocondriale (circa 658 coppie di basi) codificante la subunità I dell’enzima citocromo c ossidasi (COI). Il sequenziamento del frammento amplificato, aveva lo scopo di verificare la correttezza della identificazione morfologica. Infatti questa regione del DNA mitocondriale viene utilizzata come marcatore di elezione nell’ambito del “barcoding” delle specie animali, ovvero come marcatore di riferimento per l’identificazione univoca (molecolare) di campioni incogniti. Il barcoding prevede infatti il confronto di una sequenza incognita con sequenze depositate in apposita banca-dati di riferimento http://www.boldsystems.org, ottenute da esemplari identificati morfologicamente da esperti di ciascun gruppo tassonomico. In altre parole permette di associare un oggetto (nel nostro caso un insetto), ad una stringa di nucleotidi, seguendo la stessa procedura con cui in un supermercato il codice a barre di un prodotto ne permette l’identificazione immediata.

biologia/esperienze_possibili/sequenziamento_dna.txt · Ultima modifica: 2020/07/20 10:43 da michela.mochi