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biologia:esperienze_possibili:estrazione_con_sale

Estrazione del DNA: Protocollo salting out

DESCRIZIONE: Il metodo salting out, messo a punto da Aljanabi e Martinez nel 1997, è una procedura efficiente ed economica di estrazione del DNA che utilizza reagenti non tossici. Il protocollo prevede l’aggiunta di sali per modificare la solubilità delle proteine (gli ioni salini attraggono l’acqua, interagendo di meno con le proteine): in tal modo le proteine presenti precipitano ed è favorito il loro allontanamento dalla soluzione acquosa in cui è presente il DNA. Sono stati utilizzati in parallelo due diverse tipologie di campioni, ovvero muscolo di acciuga fresco (acquistato al mercato) e pinne di pesce pettine conservate in alcol.

MATERIALE BIOLOGICO: Pezzi di muscolo o pinna di pesce freschi o conservati in alcol 80%immagine3.jpg

REAGENTI:

  • 1. PK buffer Volume =10 ml Concentrazione finale EDTA 0,5 M 200µl 10mM TRIS 1M pH 8 1 ml 100ml SDS 20%(liquido) 1 ml 2% H2O Sigma 7,8 ml
  • 2. Proteinasi K = 20mg/ml
  • 3. NaCl 6M = 17,53 g in 50 ml acqua distillata
  • 4. Etanolo (100% e 70%)

STRUMENTAZIONE:

  • Forbici e pinzette metalliche
  • Vortex
  • Termo blocco (o bagnomaria, o stufa termostatica)
  • Micropipette di diverso volume (10-100 µl, 100 µl-1ml)
  • Centrifuga per provette da 1,5 ml
  • Freezer
  • Frigorifero

PROCEDIMENTO:

  1. Tagliare un pezzo di campione (mezzo centimetro di pinna o muscolo) ed inserirlo con una pinzetta in una provetta eppendorf da 1,5 ml, aggiungere: 300µl di Pk buffer + SDS 10µl di proteinasi K Agitare (Vortex) oppure centrifugare rapidamente.
  2. Mettere le provette nel Thermoblocco a 56 C° e 850 rpm per 2 ore (si può usare in alternativa il bagno maria oppure una stufa termostatica, alla stessa temperatura, provvedendo ad agitare le provette di tanto in tanto).
  3. Aggiungere 100µl di NaCl 6M.
  4. Agitare (vortex) ogni campione per 15 s.
  5. Centrifugare per 18 min a 13.200 giri. Questa operazione permette di isolare sul fondo della provetta una fase organica contenente le proteine ed una fase acquosa in superficie, contenente il DNA (Fig. 1)
  6. Togliere il sopranatante contenente il DNA e trasferirlo in un’altra provetta eppendorf.
  7. Aggiungere 1 ml di etanolo 100% e mescolare capovolgendo la provetta più volte.
  8. Mettere in freezer (-20 C°) per almeno 2 ore.
  9. Centrifugare a 13.200 giri per 15 min (preferibilmente a 4 C°).
  10. Rimuovere il sopranatante e aggiungere 300µl di etanolo 70%, agitare a braccio e centrifugare per 15 min.
  11. Ripetere il lavaggio per altre 2 volte.
  12. Rimuovere il sopranatante e lasciare asciugare il pellet.
  13. Aggiungere 30µl di acqua pura (DNAse free) e lasciare sospendere mettendo le provette a +4°C per una notte.
biologia/esperienze_possibili/estrazione_con_sale.txt · Ultima modifica: 2019/09/23 14:30 (modifica esterna)