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biologia:esperienze:ricerca_delle_aflatossine_nei_cereali_e_derivati

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anita.pigliacelli
biologia:esperienze:ricerca_delle_aflatossine_nei_cereali_e_derivati [2019/09/23 14:30] (versione attuale)
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-FIXME ====== RICERCA DELLE AFLATOSSINE NEI CEREALI E DERIVATI ======+FIXME 
 + ====== RICERCA DELLE AFLATOSSINE NEI CEREALI E DERIVATI ======
  
 OBIETTIVO: Verificare la presenza di aflatossine B1 mediante TLC + UV OBIETTIVO: Verificare la presenza di aflatossine B1 mediante TLC + UV
Linea 11: Linea 12:
 {{:​biologia:​esperienze:​20190328_114055_1_.jpg?​400|}} **Campioni in esame: mais contaminato da aflatossine B1** {{:​biologia:​esperienze:​20190328_114055_1_.jpg?​400|}} **Campioni in esame: mais contaminato da aflatossine B1**
  
-//​Aspergillus P. Micheli// ex Haller, 1768 è un genere di funghi della famiglia //​Trichocomaceae//​ che comprende circa 200 muffe+//​Aspergillus P. Micheli// ex Haller, 1768 è un genere di funghi della famiglia //​Trichocomaceae//​ che comprende circa 200 muffe.
 Le specie appartenenti a questo genere sono fortemente aerobiche e crescono in quasi tutti gli ambienti ricchi di ossigeno, di solito sulla superficie di un substrato. Le specie appartenenti a questo genere sono fortemente aerobiche e crescono in quasi tutti gli ambienti ricchi di ossigeno, di solito sulla superficie di un substrato.
 Molte specie si sviluppano a danno di cibi ricchi di amido, come i cereali e le patate. Molte specie si sviluppano a danno di cibi ricchi di amido, come i cereali e le patate.
 Diverse specie manifestano inoltre il fenomeno dell'​oligotrofia:​ sono in grado di crescere in ambienti poveri o addirittura privi di nutrienti fondamentali:​ //​Aspergillus niger// cresce sui muri umidi. Diverse specie manifestano inoltre il fenomeno dell'​oligotrofia:​ sono in grado di crescere in ambienti poveri o addirittura privi di nutrienti fondamentali:​ //​Aspergillus niger// cresce sui muri umidi.
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-Aspergillus flavus// è il principale responsabile della produzione di aflatossina ​in diversi prodotti agricoli, quali il mais. La contaminazione può avvenire già in campo e aumentare durante lo stoccaggio e i processi di trasformazione ​se vengono mantenute condizioni idonee per il fungoCondizioni di alta temperatura e bassa attività dell’acquaassociate a siccità nelle colture sono ottimali per //A. flavus// che diventa molto competitivo e dominante. Inoltre, ogni stress subito della pianta stimola l’attività del fungo. Nel mais,​infezioni significative ​produzione di aflatossine non si manifestano ​con umidità delle cariossidi superiori al 32%; quando ​l’umidità ​è compresa ​tra il 28% e il 13%, la produzione di tossine è molto rapida. L’ottimizzazione delle tecniche colturali e della gestione della raccolta e del post-raccolta sono fondamentali per ottenere granella con la minima contaminazione da aflatossina. L’impiego di modelli previsionali e di ceppi atossigeni,​adeguatamente selezionati e caratterizzati,​ come agenti di biocontrollo,​ rappresentano i 2 supporti più innovativi per gli agricoltori.+Aspergillus flavus// è il principale responsabile della produzione di aflatossine ​in diversi prodotti agricoli, quali il mais. In presenza di condizioni ambientali idonee alla crescita fungina, la contaminazione ​dell'​alimento da parte del fungo può avvenire già in campo e aumentare ​esponenzialmente ​durante lo stoccaggio e i processi di trasformazione. ​L'alta temperatura e la bassa attività dell’acqua associate a siccità nelle colturesono condizioni ​ottimali per la crescita di //A. flavus// che diventa molto competitivo e dominante. Inoltre, ogni stress subito della pianta stimola l’attività del fungo. Nel mais, infezioni significative ​con conseguente ​produzione di aflatossine non si manifestano ​finchè i livelli di umidità delle cariossidi ​sono superiori al 32%; quando ​i livelli di umidità ​sono compresi ​tra il 28% e il 13%, la produzione di tossine è molto rapida. ​ 
 +L’ottimizzazione delle tecniche colturali e della gestione della raccolta e del post-raccolta sono quindi ​fondamentali per ottenere granella con la minima contaminazione da aflatossina. L’impiego di modelli previsionali e di ceppi atossigeni,​adeguatamente selezionati e caratterizzati,​ come agenti di biocontrollo,​ rappresentano i 2 supporti più innovativi per gli agricoltori.
  
-Sebbene il suolo sia l’habitat primario di //​Aspergillus//​ sezione //Flavi//, poco si conosce riguardo ​al ciclo vitale di questi funghi nel suolo. Aspergillus flavus è in grado di sopravvivere e svernare nei residui colturali come micelio o sclerozi; questi rappresentano la fonte di nuovi conidi che possono iniziare il ciclo d’infezione su nuove piante ospiti. I principali fattori che influenzano la popolazione nel suolo di questi funghi sono la temperatura e l’umidità del terreno. Le temperature per la crescita di A. flavus possono variare da un minimo di 10-12°C, a un massimo di 43-48.8°C con un ottimo di 33-34°C. Il livello di+Sebbene il suolo sia l’habitat primario di //​Aspergillus//​ sezione //Flavi//, poco si conosce riguardo ​il ciclo vitale di questi funghi nel suolo. Aspergillus flavus è in grado di sopravvivere e svernare nei residui colturali come micelio o sclerozi; questi rappresentano la fonte di nuovi conidi che possono iniziare il ciclo d’infezione su nuove piante ospiti. I principali fattori che influenzano la popolazione nel suolo di questi funghi sono la temperatura e l’umidità del terreno. Le temperature per la crescita di A. flavus possono variare da un minimo di 10-12°C, a un massimo di 43-48.8°C con un ottimo di 33-34°C. Il livello di
 acqua libera (aw) necessaria per la crescita varia secondo la temperatura,​ ma //A. flavus// può crescere e produrre micotossine fino a una minima aw di 0.73 e 0.85. acqua libera (aw) necessaria per la crescita varia secondo la temperatura,​ ma //A. flavus// può crescere e produrre micotossine fino a una minima aw di 0.73 e 0.85.
-//​Aspergillus flavus// ha un’elevata efficienza nella produzione di aflatossine ​in vitro su substrato artificiale è stata osservata una produzione media giornaliera ​fino a 12 µg/kg. //​Aspergillus flavus// può rimanere attivo, o originare nuove infezioni in post-raccolta,​ e ciò può risultare in un aumento ​nella contaminazione da aflatossine se le fasi di essicazione e di stoccaggio non sono state gestite adeguatamente. L’infezione in post-raccolta è strettamente legata alla presenza del fungo in campo, infatti, le cariossidi colonizzate da //​Aspergillus//​ sezione //Flavi// rappresentano l’inoculo per l’infezione durante il periodo di stoccaggio. In questo modo, le infezioni fungine in campo possono essere un’importante fonte per la formazione di micotossine nelle successive fasi della catena di lavorazione e utilizzo.+//​Aspergillus flavus// ha un’elevata efficienza nella produzione di aflatossine; //in vitro// su substrato artificiale è stata osservata una produzione media giornaliera ​pari a 12 µg/kg. //​Aspergillus flavus// può rimanere attivo, o originare nuove infezioni in post-raccolta,​ e ciò può determinare ​un aumento ​della contaminazione da aflatossine, soprattutto ​se le fasi di essicazione e di stoccaggio non sono state gestite adeguatamente. L’infezione in post-raccolta è strettamente legata alla presenza del fungo in campo, infatti, le cariossidi colonizzate da //​Aspergillus//​ sezione //Flavi// rappresentano l’inoculo per l’infezione durante il periodo di stoccaggio. In questo modo, le infezioni fungine in campo possono essere un’importante fonte per la formazione di micotossine nelle successive fasi della catena di lavorazione e utilizzo.
 I funghi appartenenti ad //​Aspergillus//​ sezione //Flavi// sono ampiamente diffusi in natura. Vengono isolati regolarmente dal suolo, dal foraggio e dalla vegetazione in decomposizione,​ dai semi, dalla granella in stoccaggio e da diversi tipi di prodotti alimentari. Questi funghi contribuiscono al processo di decomposizione e alcuni di questi sono patogeni per gli insetti, per esempio: //A. flavus// e //A. parasiticus//​ per gli animali superiori incluso l’uomo. I funghi appartenenti ad //​Aspergillus//​ sezione //Flavi// sono ampiamente diffusi in natura. Vengono isolati regolarmente dal suolo, dal foraggio e dalla vegetazione in decomposizione,​ dai semi, dalla granella in stoccaggio e da diversi tipi di prodotti alimentari. Questi funghi contribuiscono al processo di decomposizione e alcuni di questi sono patogeni per gli insetti, per esempio: //A. flavus// e //A. parasiticus//​ per gli animali superiori incluso l’uomo.
 Le contaminazioni da aflatossine sono un fenomeno globale. Generalmente le colture nelle aree tropicali e subtropicali sono più suscettibili alla contaminazione rispetto a quelle presenti nelle regioni temperate. Il patosistema mais - //A. flavus// - ambiente è molto complesso. Il periodo della fioritura e le fasi immediatamente successive sono gli stadi di crescita dell’ospite cruciali per l’infezione da funghi e per i danni da insetti che incrementano la disseminazione degli Aspergilli, la presenza di infezioni e la produzione di aflatossine. Le contaminazioni da aflatossine sono un fenomeno globale. Generalmente le colture nelle aree tropicali e subtropicali sono più suscettibili alla contaminazione rispetto a quelle presenti nelle regioni temperate. Il patosistema mais - //A. flavus// - ambiente è molto complesso. Il periodo della fioritura e le fasi immediatamente successive sono gli stadi di crescita dell’ospite cruciali per l’infezione da funghi e per i danni da insetti che incrementano la disseminazione degli Aspergilli, la presenza di infezioni e la produzione di aflatossine.
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 Il tempo necessario alla germinazione delle spore varia in base a quanto le condizioni ecologiche sono idonee alle necessità del fungo. In particolare,​ in base al ceppo di A. flavus, il numero di giorni necessari per avere la germinazione delle spore va da 8 a 16 a 0.78aw e temperature di 33°C, aumentando fino a 95 giorni quando la temperatura aumenta o decresce di 7°C. In condizioni ottimali, la germinazione delle spore si ha dopo 1 giorno. I fattori che influenzano l’infezione,​ indipendentemente dalle condizioni ambientali, sono la concentrazione delle spore presenti in campo e la suscettibilità delle piante (che dipende dalla specie, dalla varietà e dallo stato di stress), dal sistema colturale e dalla popolazione di insetti presente. Il tempo necessario alla germinazione delle spore varia in base a quanto le condizioni ecologiche sono idonee alle necessità del fungo. In particolare,​ in base al ceppo di A. flavus, il numero di giorni necessari per avere la germinazione delle spore va da 8 a 16 a 0.78aw e temperature di 33°C, aumentando fino a 95 giorni quando la temperatura aumenta o decresce di 7°C. In condizioni ottimali, la germinazione delle spore si ha dopo 1 giorno. I fattori che influenzano l’infezione,​ indipendentemente dalle condizioni ambientali, sono la concentrazione delle spore presenti in campo e la suscettibilità delle piante (che dipende dalla specie, dalla varietà e dallo stato di stress), dal sistema colturale e dalla popolazione di insetti presente.
 Anche lo stress della pianta di mais può facilitare l’infezione da questi funghi, la produzione di micotossine e la contaminazione delle cariossidi. Siccità, caldo eccessivo, inadeguata fertilizzazione,​ presenza di insetti, presenza di erbe infestanti, eccessivo numero di piante e presenza di altre malattie possono comportare stress alla pianta e facilitare l’infezione delle cariossidi. Anche lo stress della pianta di mais può facilitare l’infezione da questi funghi, la produzione di micotossine e la contaminazione delle cariossidi. Siccità, caldo eccessivo, inadeguata fertilizzazione,​ presenza di insetti, presenza di erbe infestanti, eccessivo numero di piante e presenza di altre malattie possono comportare stress alla pianta e facilitare l’infezione delle cariossidi.
-Nel mais, infezioni significative e produzione di aflatossine ​non si manifestano ​fino a che l’umidità delle cariossidi è superiore al 32%; quando lumidità scende sotto il 28% l’incremento di produzione delle tossine è molto rapido. Le aflatossine possono continuare a essere prodotte finché l’umidità della granella non raggiunge il 13%. A questo riguardo è molto importante la dinamica dell’aw nella granella durante la fase di maturazione. Se il danno da insetti ha luogo dopo che la coltura ha raggiunto un livello di umidità non favorevole alla crescita fungina, ci si aspetta che il livello di aflatossine rimarrà basso finché la pioggia successiva non andrà a incrementare nuovamente l’umidità della granella. +Nel mais, infezioni significative e produzione di aflatossine si manifestano quando l'umidità scende sotto il 28%. Le aflatossine possono continuare a essere prodotte finché l’umidità della granella non raggiunge il 13%. A questo riguardo è molto importante la dinamica dell’aw nella granella durante la fase di maturazione. Se il danno da insetti ha luogo dopo che la coltura ha raggiunto un livello di umidità non favorevole alla crescita fungina, ci si aspetta che il livello di aflatossine rimarrà basso finché la pioggia successiva non andrà a incrementare nuovamente l’umidità della granella. 
-Anche il momento ​in cui la raccolta ​ha luogo, ​influenza il livello di aflatossine nella granella: ​con raccolte ritardate si rileva un aumento nel livello di aflatossine. ​L’effetto delle raccolte ritardate è più grave quando le colture vengono bagnate dalla pioggia appena prima o durante la raccolta; ​comunque, anche in annate in cui non intervengono piogge durante la fase finale di maturazione,​ un ritardo della raccolta di 2 settimane può comportare, a fronte di un calo di umidità di 6-7 punti percentuali (da 26-27% a 19-20%) almeno un raddoppio del contenuto di aflatossine nelle cariossidi.+Anche il momento ​della raccolta influenza il livello di aflatossine nella granella: ​nelle raccolte ritardate si rileva un aumento nel livello di aflatossine. ​questa condizione si aggrava ​quando le colture vengono bagnate dalla pioggia appena prima o durante la raccolta; ​tuttavia, anche in annate in cui non intervengono piogge durante la fase finale di maturazione,​ un ritardo della raccolta di 2 settimane può comportare, a fronte di un calo di umidità di 6-7 punti percentuali (da 26-27% a 19-20%) almeno un raddoppio del contenuto di aflatossine nelle cariossidi.
 In campo, un importante fattore da considerare è che i funghi sembrano continuare a sintetizzare e degradare aflatossine. Conseguentemente,​ i cambiamenti ambientali giornalieri possono modificare l’entità delle due vie metaboliche e quindi influenzare il livello finale di tossina. In campo, un importante fattore da considerare è che i funghi sembrano continuare a sintetizzare e degradare aflatossine. Conseguentemente,​ i cambiamenti ambientali giornalieri possono modificare l’entità delle due vie metaboliche e quindi influenzare il livello finale di tossina.
  
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-Le aflatossine sono micotossine prodotte da due specie di //​Aspergillus//,​ un fungo che si trova soprattutto in zone caratterizzate da clima caldo e umido. ​Poiché le aflatossine sono note per le loro proprietà genotossiche e cancerogene,​ l'​esposizione del consumatore tramite gli alimenti deve essere mantenuta quanto più bassa possibile. Le aflatossine possono essere presenti in prodotti alimentari come arachidi, frutta a guscio, granoturco, riso, fichi e altra frutta secca, spezie, oli vegetali grezzi e semi di cacao, a seguito di contaminazioni fungine avvenute prima e dopo la raccolta. In natura esistono diversi tipi di aflatossine. L'​aflatossina B1 è la più diffusa nei prodotti alimentari ed è una delle più potenti in termini di genotossicità e cancerogenicità. È prodotta sia dall’//​Aspergillus flavus// sia dall’//​Aspergillus parasiticus//​. L'​aflatossina M1 è uno dei principali metaboliti dell'​aflatossina B1 nell'​uomo e negli animali e può essere presente nel latte proveniente da animali nutriti con mangimi contaminati da aflatossina B1.Esistono svariati tipi di aflatossine,​ i principali sono:​B1,​B2,​G1,​G2.+//​Aspergillus//, ​è un fungo che si trova soprattutto in zone caratterizzate da clima caldo e umido. ​Il fungo è noto per la capacità di produrre tossine con proprietà genotossiche e cancerogene, ​pertanto ​l'​esposizione del consumatore tramite gli alimenti deve essere mantenuta quanto più bassa possibile. Le aflatossine possono essere presenti in prodotti alimentari come arachidi, frutta a guscio, granoturco, riso, fichi e altra frutta secca, spezie, oli vegetali grezzi e semi di cacao, a seguito di contaminazioni fungine avvenute prima e dopo la raccolta. In natura esistono diversi tipi di aflatossine. L'​aflatossina B1 è la più diffusa nei prodotti alimentari ed è una delle più potenti in termini di genotossicità e cancerogenicità. È prodotta sia dall’//​Aspergillus flavus// sia dall’//​Aspergillus parasiticus//​. L'​aflatossina M1 è uno dei principali metaboliti dell'​aflatossina B1 nell'​uomo e negli animali e può essere presente nel latte proveniente da animali nutriti con mangimi contaminati da aflatossina B1.Esistono svariati tipi di aflatossine,​ i principali sono:​B1,​B2,​G1,​G2.
  
 I derivati metabolici M1 e M2 I derivati metabolici M1 e M2
-Le lettere B e G derivano dalle iniziali delle parole inglesi "​blue"​ (blu) e "​green"​ (verde) che indicano il tipo di fluorescenza emesso da tali sostanze quando sono sottoposte a luce ultravioletta di 360 nm. La lettera M, invece, è l'​iniziale della parola inglese "​milk",​ cioè latte, dove originariamente fu trovata ​la sostanza.+Le lettere B e G derivano dalle iniziali delle parole inglesi "​blue"​ (blu) e "​green"​ (verde) che indicano il tipo di fluorescenza emesso da tali sostanze quando sono sottoposte a luce ultravioletta di 360 nm. La lettera M, invece, è l'​iniziale della parola inglese "​milk",​ cioè latte, dove originariamente fu identificata ​la sostanza.
  
 **TLC+UV** **TLC+UV**
  
-In questa ​tecnica cromatograficala fase stazionaria è costituita da materiali ​diversi ​(solidi attivi, liquidi supportati su particelle solide inerti, cellulose modificate scambiatrici di ioni) stratificati a spessori sottili su superfici piane (lastrine di vetro, fogli di alluminio, fibre di vetro, fogli o lastre di resine) che ne costituiscono il supportto meccanico. +La cromatografia su strato sottile o TLC (Thin layer chromatography) è tecnica cromatografica ​che può essere utilizzata per identificare ​la presenza di tossine negli alimenti. Il principio su cui si basa è la separazione delle sostanze che si muovono tra una fase stazionaria e una fase mobile. La fase stazionaria è costituita da materiali ​di diverso tipo (solidi attivi, liquidi supportati su particelle solide inerti, cellulose modificate scambiatrici di ioni) stratificati a spessori sottili su superfici piane (lastrine di vetro, fogli di alluminio, fibre di vetro, fogli o lastre di resine) che ne costituiscono il supportto meccanico. La fase mobile è costituita da un solvente 
-La TLC (Thin layer chromatography) si può considerare una moderna evoluzione della cromatografia su carta (PC). I meccanismi di separazione dei componenti delle miscelesi basano sui fenomeni di: +I meccanismi di separazione dei componenti delle miscele si basano sui fenomeni di: 
--adsorbimento:​ se la fase stazionaria è costituita da un solido granulare attivo (dotato cioè della capacità di formare sulla superficie dei granulilegami chimici secondari con le molecole dei componenti le miscele).+-adsorbimento:​ se la fase stazionaria è costituita da un solido granulare attivo (dotato cioè della capacità di formare sulla superficie dei granuli legami chimici secondari con le molecole dei componenti le miscele).
 -ripartizione:​ se la fase stazionaria è un liquido fissato su un supporto solido granulare, possibilmente del tutto inerte. -ripartizione:​ se la fase stazionaria è un liquido fissato su un supporto solido granulare, possibilmente del tutto inerte.
 -scambio ionico: se la fase stazionaria ha la capacità di scambiare ioni. -scambio ionico: se la fase stazionaria ha la capacità di scambiare ioni.
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 -gel di silice: acido silicico amorfo polimerizzato,​ poroso; presenta molti gruppi -OH liberi come gruppi funzionali attivi. -gel di silice: acido silicico amorfo polimerizzato,​ poroso; presenta molti gruppi -OH liberi come gruppi funzionali attivi.
 -allumina (neutra, basica, acida): si ottiene con tecniche diverse da idrossido di alluminio disidratato ad alta temperatura;​ può presentare diversi gradi di attività a seconda delle percentuali di acqua residue, presenti nel materiale. -allumina (neutra, basica, acida): si ottiene con tecniche diverse da idrossido di alluminio disidratato ad alta temperatura;​ può presentare diversi gradi di attività a seconda delle percentuali di acqua residue, presenti nel materiale.
-Le diverse attività sono classificate secondo una scala che va da I a V nel senso delle capacità di adsorbimento decrescenti+Le diverse attività sono classificate secondo una scala che va da I a V nel senso delle capacità di adsorbimento decrescenti.
  
 **Fasi stazionarie liquide (ripartizione)** **Fasi stazionarie liquide (ripartizione)**
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 **Fasi mobili** **Fasi mobili**
-Sono in genere solventi organici a diversa polarità. Esistono in letteratura degli elenchi di solventi organici utilizzabili come fasi mobili, scelti da vari Autori ​e disposti in ordine di serie eluotropiche (polarità crescente ).+Sono in genere solventi organici a diversa polarità. Esistono in letteratura degli elenchi di solventi organici utilizzabili come fasi mobili, scelti da vari autori ​e disposti in ordine di serie eluotropiche (polarità crescente).
  
 **Apparecchiature** **Apparecchiature**
-Per quanto riguarda le apparecchiature ​si possono citare+La corsa cromatografica avviene con l'​ausilio di una delle seguenti ​apparecchiature:​ 
--camere di sviluppo: sono in vetro, di dimensioni e formati diversi, munite di coperchi a tenuta. Alla loro base vengono versati gli eluenti (solventi puri o miscele di solventi). +-camere di sviluppo: sono in vetro, di dimensioni e formati diversi, munite di coperchi a tenuta. Alla loro base vengono versati gli eluenti (solventi puri o miscele di solventi). Le lastrine di vetro su cui è stratificato lo strato sottile di fase stazionaria,​ “pescano” nell’eluente,​ che sale attraverso di esse per capillarità (tecnica ascendente). 
-Le lastrine di vetro su cui è stratificato lo strato sottile di fase stazionaria,​ “pescano” nell’eluente,​ che sale attraverso di esse per capillarità (tecnica ascendente). +Le camere devono essere a tenuta perchè l’ambiente deve risultare saturo dei vapori dell’eluente;​ in un ambiente non saturo, ​il solvente ​non salirebbe infatti attraverso la lastrina oltre una certa altezza perchè si stabilirebbe un equilibrio tra liquido che sale per capillarità ed eluente che evapora. 
-Le camere devono essere a tenuta perchè l’ambiente deve risultare saturo dei vapori dell’eluente;​ in un ambiente non saturo, ​questo ​non salirebbe infatti attraverso la lastrina oltre una certa altezza perchè si stabilirebbe un equilibrio tra liquido che sale per capillarità ed eluente che evapora. +-stratificatore:​ apparecchiatura su cui si dispongono le lastrine di vetro lavate e sgrassate. Si fa scorrere su esse (manualmente o automaticamente) una vaschetta contenente una sospensione della fase stazionaria in acqua. Al materiale costituente la fase stazionaria,​ contenente generalmente anche CaSO4 come legante, per farla aderire alle lastrine, si possono aggiungere, nel preparare la  sospensione,​ degli indicatori di fluorescenza (F254 e/o F366). Questi indicatori consentono, irradiando le lastrine al buio con lampade di Wood che emettono nelle zone 254 e 366 nm, di vedere le sostanze non colorate presenti su di esse, scure sullo sfondo luminoso fluorescente della lastrina attivata. La vaschettascorrendo sulle lastrine, lascia dietro di sè uno strato di fase stazionaria di spessore regolabile. Dopo la stratificazione le lastrine si essiccano prima all’aria e poi si attivano in stufa. Oggi sono disponibili in commercio lastrine già pronte del tipo “usa e getta” confezionate con le fasi stazionarie più importanti; esse hanno uno spessore di strato e una granulometria controllati e quindi presentano una maggiore
--stratificatore:​ apparecchiatura su cui si dispongono le lastrine di vetro lavate e sgrassate. Si fa scorrere su esse (manualmente o automaticamente) una vaschetta contenente una sospensione della fase stazionaria in acqua. Al materiale costituente la fase stazionaria,​ contenente generalmente anche CaSO4 come legante, per farla aderire alle lastrine, si possono aggiungere, nel preparare la  sospensione,​ degli indicatori di fluorescenza (F254 e/o F366). Questi indicatori consentono, irradiando le lastrine al buio con lampade di Wood che emettono nelle zone 254 e 366 nm, di vedere le sostanze non colorate presenti su di esse, scure sullo sfondo luminoso ​ fluorescente della lastrina attivata. La vaschetta scorrendo sulle lastrine, lascia dietro di sè uno strato di fase stazionaria di spessore regolabile. Dopo la stratificazione le lastrine si essiccano prima +
-all’aria e poi si attivano in stufa. Oggi sono disponibili in commercio lastrine già pronte del tipo “usa e getta” confezionate con le fasi stazionarie più importanti; esse hanno uno spessore di strato e una granulometria controllati e quindi presentano una maggiore+
 efficienza e migliore riproducibilità di risultati. efficienza e migliore riproducibilità di risultati.
--depositori dei campioni: possono essere o dei semplici capillari di vetro o dei microcapillari tarati, micropipette,​ microsiringhe di precisione, ecc. 
  
 **Cenni sull’analisi qualitativa e quantitativa in TLC** **Cenni sull’analisi qualitativa e quantitativa in TLC**
  
 **Analisi qualitativa** ​ **Analisi qualitativa** ​
-L’identificazione di un componente tramite misura del valore del suo R +Per l'​analisi quantitativa delle componenti separate si utilizza frequentemente ​uno standard ​che viene fatto migrare sulla stessa lastrina, in parallelo con la miscela. Sostanze che migrano alla stessa altezza e che assumono la stessa colorazione con rivelatori specifici, possono ritenersi ragionevolmente uguali. ​In alternativa, ​la banda localizzata mediante ​lampada UV può essere asportata ​insieme alla fase stazionaria, ​ed eluita ​con un solvente ​per la successiva ​identificazione ​mediante l'​ausilio di altre tecniche analitiche ​come IR, UV, GC, HPLC, MS.
-f assoluto non dà affidamento a causa dei numerosi fattori che influenzano i risultati di una TLC e che ne compromettono la riproducibilità. +
-I metodi preferibili sono invece: +
--confronto con uno standard fatto migrare sulla stessa lastrina, in parallelo con la miscela. Sostanze che migrano alla stessa altezza e che assumono la stessa colorazione con rivelatori specifici, possono ritenersi ragionevolmente uguali. +
--localizzazione della macchia (o della banda) con la lampada UV o con la tecnica della doppia semina (una si sacrifica spruzzando con il rivelatore per localizzarla e l’altra si usa per l’analisi),​ sua asportazione ​insieme alla fase stazionaria, ​eluizione ​con un solvente ​ed identificazione ​conclusiva con altre metodiche strumentali ​come IR, UV, GC, HPLC, MS.+
  
 **Analisi quantitativa** **Analisi quantitativa**
 L’analisi quantitativa in TLC non offre un’accuratezza ed una riproducibilità elevate. L’analisi quantitativa in TLC non offre un’accuratezza ed una riproducibilità elevate.
 Tuttavia i metodi più accurati ed affidabili sono: Tuttavia i metodi più accurati ed affidabili sono:
--determinazione dell’intensità delle colorazioni delle macchie mediante una misura delle loro riflettanze con un fotodensitometro a scansione +-la determinazione dell’intensità delle colorazioni delle macchie mediante una misura delle loro riflettanze con un fotodensitometro a scansione. 
--localizzazione delle macchie mediante UV e indicatori di fluorescenza oppure con la tecnica della doppia semina; le macchie vengono quindi asportate insieme alla fase stazionaria,​ eluite con un solvente e dosate per via strumentale (spettrofotometria,​ GC, ecc.)+-la localizzazione delle macchie mediante UV e indicatori di fluorescenza oppure con la tecnica della doppia semina; le macchie vengono quindi asportate insieme alla fase stazionaria,​ eluite con un solvente e dosate per via strumentale (spettrofotometria,​ GC, ecc.)
  
 **Tecniche operative** **Tecniche operative**
Linea 106: Linea 101:
 **sviluppo del cromatogramma**: ​ **sviluppo del cromatogramma**: ​
  
-si immerge la lastrina nell’eluente (fase mobile) posto alla base della camera di sviluppo, facendo attenzione a che la linea di partenza sia al di sopra del pelo libero della fase mobile. Si chiude il coperchio a tenuta; l’eluente sale attraverso la +si immerge la lastrina nell’eluente (fase mobile) posto alla base della camera di sviluppo ​e si chiude il coperchio a tenuta; l’eluente sale attraverso la lastrina per capillarità (sviluppo ascendente),​ trasportando con sè le macchie (o la banda). Il trasporto è selettivo perchè, a causa delle diverse polarità dei componenti la miscela, questi risultano più o meno affini alla fase stazionaria. I componenti più affini (adsorbiti più fortemente sulla fase stazionaria solida o più solubili nella fase stazionaria se liquida) restano indietro perchè maggiormente trattenuti dalla fase stazionaria;​ i meno affini ad essa vengono invece trasportati dall’eluente,​ più in alto. 
-lastrina per capillarità (sviluppo ascendente),​ trasportando con sè le macchie (o la banda). Il trasporto è selettivo perchè, a causa delle diverse polarità dei componenti la miscela, questi risultano più o meno affini alla fase stazionaria. I componenti più affini (adsorbiti più fortemente sulla fase stazionaria solida o più solubili nella fase stazionaria se liquida) restano indietro perchè maggiormente trattenuti dalla fase stazionaria;​ i meno affini ad essa vengono invece trasportati dall’eluente,​ più in alto. +L’eluente viene fatto migrare per un certo tratto (di solito 15-16 cm) per lastrine di dimensioni 20x20cm, quindi si segna con una matita la linea cui è arrivato (fronte del solvente) e si toglie la lastrina dalla camera di sviluppo. ​
-L’eluente viene fatto migrare per un certo tratto (di solito 15-16cm) per lastrine di dimensioni 20x20cm, quindi si segna con una matita la linea cui è arrivato (fronte del solvente) e si toglie la lastrina dalla camera di sviluppo. ​+
  
 **rivelazione del cromatogramma**:​ **rivelazione del cromatogramma**:​
  
-dopo aver fatto evaporare all’aria l’eluente che bagna la lastrina, si passa alla rivelazione del cromatogramma. La rivelazione ​può essere fatta in due modi :  +La rivelazione del cromatogramma può essere fatta in due modi :  
--rivelazione con sistemi non distruttivi:​ le lastrine, con fasi stazionarie addizionate di indicatori di fluorescenza sensibili alle radiazioni UV comprese in un certo range di lunghezze d’onda, vengono irradiate con lampade che emettono in una banda intorno a +-rivelazione con sistemi non distruttivi:​ le lastrine, con fasi stazionarie addizionate di indicatori di fluorescenza sensibili alle radiazioni UV comprese in un certo range di lunghezze d’onda, vengono irradiate con lampade che emettono in una banda intorno a 254 nm e 366 nm. Osservate al buio, esse presentano una fluorescenza verde che lascia vedere la posizione delle macchie o delle bande (scure in campo chiaro). Esse si possono ​circoscrivere ​con una matita e quindi si può eventualmente asportare la fase stazionaria dalla lastrina grattando con una spatola.
-254 nm e 366 nm. Osservate al buio, esse presentano una fluorescenza verde che lascia vedere la posizione delle macchie o delle bande (scure in campo chiaro). Esse si possono ​segnare ​con una matita e quindi si può eventualmente asportare la fase stazionaria dalla lastrina grattando con una spatola.+
 -rivelazione chimica (distruttiva):​ le lastrine vengono spruzzate con soluzioni di reattivi che reagiscono con i componenti sviluppando,​ a temperatura ambiente o a caldo, delle macchie colorate che individuano i diversi componenti della miscela e gli standard di confronto. I rivelatori chimici si possono distinguere in “universali”,​ di uso generale e capaci di rivelare qualunque composto, e “specifici” che reagiscono solo con determinate classi di composti (es. ninidrina per gli amminoacidi,​ SbCl3 in cloroformio per terpeni, steroidi ecc. -rivelazione chimica (distruttiva):​ le lastrine vengono spruzzate con soluzioni di reattivi che reagiscono con i componenti sviluppando,​ a temperatura ambiente o a caldo, delle macchie colorate che individuano i diversi componenti della miscela e gli standard di confronto. I rivelatori chimici si possono distinguere in “universali”,​ di uso generale e capaci di rivelare qualunque composto, e “specifici” che reagiscono solo con determinate classi di composti (es. ninidrina per gli amminoacidi,​ SbCl3 in cloroformio per terpeni, steroidi ecc.
    
 **Prestazioni** **Prestazioni**
  
-I principali parametri ​con cui si valutano le prestazioni di una TLC sono:+I principali parametri ​utilizzati por la valutazione delle prestazioni di una TLC sono:
 -selettività;​ -selettività;​
 -efficienza;​ -efficienza;​
Linea 163: Linea 156:
  
 **  Inoculo dello sfarinato con i ceppi fungini** **  Inoculo dello sfarinato con i ceppi fungini**
-  * posizionare un disco di carta assorbente sul fondo delle Piastre di Petri sterili da 9 com+  * posizionare un disco di carta assorbente sul fondo delle Piastre di Petri sterili da 9 cm
-  *  aggiungere 8g di mais macinato;+  * aggiungere 8g di mais macinato;
   * bagnare il mais con 5 mL di acqua sterile;   * bagnare il mais con 5 mL di acqua sterile;
-  *  aggiungere 500 μL di una sospensione conidica (10^6 so/​mL). ​gli ascomiceti utilizzati per l'​esperimento sono i seguenti: //​Aspergillus Flavus, Aspergillus carbonarius e Fusarium verticillioides//;​+  * aggiungere 500 μL di una sospensione conidica (10^6 so/​mL). ​Gli ascomiceti utilizzati per l'​esperimento sono i seguenti: //​Aspergillus Flavus, Aspergillus carbonarius e Fusarium verticillioides//;​
   *  lasciar crescere per 7 giorni in un termostato al buio a 25° C.   *  lasciar crescere per 7 giorni in un termostato al buio a 25° C.
  
Linea 179: Linea 172:
  ​{{:​biologia:​esperienze:​20190328_115422_1_.jpg?​200|}}  ​{{:​biologia:​esperienze:​20190328_115422_1_.jpg?​200|}}
  
-  * aggiungere 1 mL contenente Etil-acetato : Isopropanolo : acqua nel rapporto **3 : 1 : 1** (non formare un mix ma aggiungere 600 μL di Etil-acetato e vortexare per 1 minuto; 200 μL di isopropanolo e vortexare per 1 minuto; aggiungere 200 μL di acqua e vortexare per 1 minuto);+  * aggiungere 1 mL contenente Etil-acetato : Isopropanolo : acqua nel rapporto **3 : 1 : 1** (aggiungere 600 μL di Etil-acetato e vortexare per 1 minuto; 200 μL di isopropanolo e vortexare per 1 minuto; aggiungere 200 μL di acqua e vortexare per 1 minuto);
   *  vortexare;   *  vortexare;
  
Linea 185: Linea 178:
    
   *  lasciare in agitazione per 5 minuti;   *  lasciare in agitazione per 5 minuti;
-  *    centrifugare per 10 minuti a 7000 rpm o lasciare 15 minuti a temperatura ambiente per far separare le fasi;+  *  centrifugare per 10 minuti a 7000 rpm o lasciare 15 minuti a temperatura ambiente per far separare le fasi;
  
 {{:​biologia:​esperienze:​20190328_120949_1_.jpg?​200|}} {{:​biologia:​esperienze:​20190328_120949_1_.jpg?​200|}}
Linea 207: Linea 200:
 **OSSERVAZIONE E CONCLUSIONE** ​ **OSSERVAZIONE E CONCLUSIONE** ​
  
-L'​aflatossina B1, se presente, ​sotto radiazioni UV-visibile con lunghezza d'onda di 463nm, da fluorescenzaPossiamo notare come nel caso 1, in cui abbiamo ​una contaminazione vera e propria, tutti i campioni ​diano fluorescenza. Nel caso 2, in cui abbiamo ​alimenti contaminati, ​si può notare come solo lo standard di AFLAB1 ​dia fluorescenza;​ ciò sta significare ​che in un tutti i campioni l'​aflatossina B1 non è presente. +L'​aflatossina B1 è visualizzabile ​sotto radiazioni UV-visibile con lunghezza d'onda di 463nm. ​Nel caso dell'​esperienza ​1, in cui avevamo ​una contaminazione vera e propria ​da Aspergiullus flavus, tutti i campioni ​di mais contaminati dal fungo hanno mostrato un segnale di fluorescenza ​compatibile con la presenza di aflatossina B1. Nel caso dell'​esperienza ​2, in cui avevamo ​alimenti ​potenzialmente ​contaminati, ​senza conoscere a priori la tipologia di fungo eventualmente presente, non è stata osservata la presenza di aflatossina B1. Infatti, l'​unico segnale di fluorescenza osservato è stato quello relativo allo standard di AFLAB1 a dimostrare ​che tutti i campioni ​alimentari analizzati erano privi di l'​aflatossina B1. 
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biologia/esperienze/ricerca_delle_aflatossine_nei_cereali_e_derivati.txt · Ultima modifica: 2019/09/23 14:30 (modifica esterna)