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biologia:esperienze:ricerca_delle_aflatossine_nei_cereali_e_derivati

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RICERCA DELLE AFLATOSSINE NEI CEREALI E DERIVATI

OBIETTIVO: Verificare la presenza di aflatossine B1 mediante TLC + UV

PRINCIPIO TEORICO:

Campioni in esame: mais contaminato da aflatossine B1

Aspergillus P. Micheli ex Haller, 1768 è un genere di funghi della famiglia Trichocomaceae che comprende circa 200 muffe. Le specie appartenenti a questo genere sono fortemente aerobiche e crescono in quasi tutti gli ambienti ricchi di ossigeno, di solito sulla superficie di un substrato. Molte specie si sviluppano a danno di cibi ricchi di amido, come i cereali e le patate. Diverse specie manifestano inoltre il fenomeno dell'oligotrofia: sono in grado di crescere in ambienti poveri o addirittura privi di nutrienti fondamentali: Aspergillus niger cresce sui muri umidi. Aspergillus flavus è il principale responsabile della produzione di aflatossine in diversi prodotti agricoli, quali il mais. In presenza di condizioni ambientali idonee alla crescita fungina, la contaminazione dell'alimento da parte del fungo può avvenire già in campo e aumentare esponenzialmente durante lo stoccaggio e i processi di trasformazione. L'alta temperatura e la bassa attività dell’acqua associate a siccità nelle colture, sono condizioni ottimali per la crescita di A. flavus che diventa molto competitivo e dominante. Inoltre, ogni stress subito della pianta stimola l’attività del fungo. Nel mais, infezioni significative con conseguente produzione di aflatossine non si manifestano finchè i livelli di umidità delle cariossidi sono superiori al 32%; quando i livelli di umidità sono compresi tra il 28% e il 13%, la produzione di tossine è molto rapida. L’ottimizzazione delle tecniche colturali e della gestione della raccolta e del post-raccolta sono quindi fondamentali per ottenere granella con la minima contaminazione da aflatossina. L’impiego di modelli previsionali e di ceppi atossigeni,adeguatamente selezionati e caratterizzati, come agenti di biocontrollo, rappresentano i 2 supporti più innovativi per gli agricoltori.

Sebbene il suolo sia l’habitat primario di Aspergillus sezione Flavi, poco si conosce riguardo il ciclo vitale di questi funghi nel suolo. Aspergillus flavus è in grado di sopravvivere e svernare nei residui colturali come micelio o sclerozi; questi rappresentano la fonte di nuovi conidi che possono iniziare il ciclo d’infezione su nuove piante ospiti. I principali fattori che influenzano la popolazione nel suolo di questi funghi sono la temperatura e l’umidità del terreno. Le temperature per la crescita di A. flavus possono variare da un minimo di 10-12°C, a un massimo di 43-48.8°C con un ottimo di 33-34°C. Il livello di acqua libera (aw) necessaria per la crescita varia secondo la temperatura, ma A. flavus può crescere e produrre micotossine fino a una minima aw di 0.73 e 0.85. Aspergillus flavus ha un’elevata efficienza nella produzione di aflatossine; in vitro su substrato artificiale è stata osservata una produzione media giornaliera pari a 12 µg/kg. Aspergillus flavus può rimanere attivo, o originare nuove infezioni in post-raccolta, e ciò può determinare un aumento della contaminazione da aflatossine, soprattutto se le fasi di essicazione e di stoccaggio non sono state gestite adeguatamente. L’infezione in post-raccolta è strettamente legata alla presenza del fungo in campo, infatti, le cariossidi colonizzate da Aspergillus sezione Flavi rappresentano l’inoculo per l’infezione durante il periodo di stoccaggio. In questo modo, le infezioni fungine in campo possono essere un’importante fonte per la formazione di micotossine nelle successive fasi della catena di lavorazione e utilizzo. I funghi appartenenti ad Aspergillus sezione Flavi sono ampiamente diffusi in natura. Vengono isolati regolarmente dal suolo, dal foraggio e dalla vegetazione in decomposizione, dai semi, dalla granella in stoccaggio e da diversi tipi di prodotti alimentari. Questi funghi contribuiscono al processo di decomposizione e alcuni di questi sono patogeni per gli insetti, per esempio: A. flavus e A. parasiticus per gli animali superiori incluso l’uomo. Le contaminazioni da aflatossine sono un fenomeno globale. Generalmente le colture nelle aree tropicali e subtropicali sono più suscettibili alla contaminazione rispetto a quelle presenti nelle regioni temperate. Il patosistema mais - A. flavus - ambiente è molto complesso. Il periodo della fioritura e le fasi immediatamente successive sono gli stadi di crescita dell’ospite cruciali per l’infezione da funghi e per i danni da insetti che incrementano la disseminazione degli Aspergilli, la presenza di infezioni e la produzione di aflatossine. Il ciclo vitale di A. flavus può essere diviso in due parti principali: la colonizzazione dei residui colturali nel terreno e l’infezione dei tessuti della coltura. All’inizio della stagione colturale, quando le condizioni ambientali iniziano a essere favorevoli, gli sclerozi, le strutture di svernamento, germinano producendo un micelio che differenzia numerosi conidiofori che rilasciano conidi nell’aria. Il teleomorfo (stadio sessuale) di A. flavus non è mai stato osservato in natura; pertanto, i conidi costituiscono l’inoculo primario. Dal suolo, i conidi vengono trasportati dall’aria e depositati sulle sete e sulle cariossidi; nei giorni di pioggia la dispersione delle spore non avviene. Le colture infettate contribuiscono all’aumento dell’inoculo presente nel terreno durante gli anni aridi. Il tempo necessario alla germinazione delle spore varia in base a quanto le condizioni ecologiche sono idonee alle necessità del fungo. In particolare, in base al ceppo di A. flavus, il numero di giorni necessari per avere la germinazione delle spore va da 8 a 16 a 0.78aw e temperature di 33°C, aumentando fino a 95 giorni quando la temperatura aumenta o decresce di 7°C. In condizioni ottimali, la germinazione delle spore si ha dopo 1 giorno. I fattori che influenzano l’infezione, indipendentemente dalle condizioni ambientali, sono la concentrazione delle spore presenti in campo e la suscettibilità delle piante (che dipende dalla specie, dalla varietà e dallo stato di stress), dal sistema colturale e dalla popolazione di insetti presente. Anche lo stress della pianta di mais può facilitare l’infezione da questi funghi, la produzione di micotossine e la contaminazione delle cariossidi. Siccità, caldo eccessivo, inadeguata fertilizzazione, presenza di insetti, presenza di erbe infestanti, eccessivo numero di piante e presenza di altre malattie possono comportare stress alla pianta e facilitare l’infezione delle cariossidi. Nel mais, infezioni significative e produzione di aflatossine si manifestano quando l'umidità scende sotto il 28%. Le aflatossine possono continuare a essere prodotte finché l’umidità della granella non raggiunge il 13%. A questo riguardo è molto importante la dinamica dell’aw nella granella durante la fase di maturazione. Se il danno da insetti ha luogo dopo che la coltura ha raggiunto un livello di umidità non favorevole alla crescita fungina, ci si aspetta che il livello di aflatossine rimarrà basso finché la pioggia successiva non andrà a incrementare nuovamente l’umidità della granella. Anche il momento della raccolta influenza il livello di aflatossine nella granella: nelle raccolte ritardate si rileva un aumento nel livello di aflatossine. questa condizione si aggrava quando le colture vengono bagnate dalla pioggia appena prima o durante la raccolta; tuttavia, anche in annate in cui non intervengono piogge durante la fase finale di maturazione, un ritardo della raccolta di 2 settimane può comportare, a fronte di un calo di umidità di 6-7 punti percentuali (da 26-27% a 19-20%) almeno un raddoppio del contenuto di aflatossine nelle cariossidi. In campo, un importante fattore da considerare è che i funghi sembrano continuare a sintetizzare e degradare aflatossine. Conseguentemente, i cambiamenti ambientali giornalieri possono modificare l’entità delle due vie metaboliche e quindi influenzare il livello finale di tossina.

La prevenzione della contaminazione da aflatossine

L’ottimizzazione delle tecniche colturali e della gestione della raccolta e del post-raccolta rappresentano certamente la base per ottenere granella con la minima contaminazione da aflatossine. Questo comporta in genere un aumento dei costi di produzione; ad esempio, la raccolta precoce, con umidità della granella non troppo bassa, comporta un maggior costo per l’essicca- zione. Pertanto, soprattutto in un’area geografica come il nord Italia, dove le contaminazioni si presentano con intensità assai variabile tra gli anni e le zone geografiche, risulta particolarmente importante individuare altri mezzi a supporto della razionalizzazione della gestione di filiera. In particolare, sono stati fatti notevoli sforzi per lo sviluppo di un modello previsionale affidabile, in grado di prevedere le condizioni di rischio sia delle aree geografiche, sulla base di dati storici, sia dei singoli appezzamenti durante la stagione colturale, utilizzando come input i dati raccolti in tempo reale, sia in scenari di cambiamenti climatici, utilizzando dati meteorologici simulati in proiezioni future.

Micotossine: aflatossine B1

Le micotossine sono delle molecole prodotte naturalmente da alcune specie di funghi parassiti che crescono e si sviluppano sulle piante in campo o nelle derrate alimentari durante lo stoccaggio. Esse causano una reazione tossica ogni qualvolta vengano ingerite dall’uomo e dagli altri animali provocando l’insorgenza di micotossicosi acute o croniche. Tutte le materie prime di origine vegetale sono suscettibili di contaminazione da micotossine. L’esposizione dell’uomo alle micotossine può verificarsi principalmente attraverso il consumo di alimenti di origine vegetale contaminati o l’ingestione di residui o metaboliti contenuti in alimenti e bevande (latte e derivati, carne e insaccati) derivanti da animali alimentati con mangimi contaminati. Oltre ai problemi di tipo sanitario, la contaminazione delle derrate può provocare ingenti perdite economiche. Tra i funghi che rivestono una particolare importanza micotossicologica per la loro diffusione e elevata tossicità sono da ricordare i generi: Aspergillus, Penicillium, Fusarium. A questi si aggiungono altri generi che tuttavia comprendono ceppi di interesse micotossicologico più limitato.

Aspergillus, è un fungo che si trova soprattutto in zone caratterizzate da clima caldo e umido. Il fungo è noto per la capacità di produrre tossine con proprietà genotossiche e cancerogene, pertanto l'esposizione del consumatore tramite gli alimenti deve essere mantenuta quanto più bassa possibile. Le aflatossine possono essere presenti in prodotti alimentari come arachidi, frutta a guscio, granoturco, riso, fichi e altra frutta secca, spezie, oli vegetali grezzi e semi di cacao, a seguito di contaminazioni fungine avvenute prima e dopo la raccolta. In natura esistono diversi tipi di aflatossine. L'aflatossina B1 è la più diffusa nei prodotti alimentari ed è una delle più potenti in termini di genotossicità e cancerogenicità. È prodotta sia dall’Aspergillus flavus sia dall’Aspergillus parasiticus. L'aflatossina M1 è uno dei principali metaboliti dell'aflatossina B1 nell'uomo e negli animali e può essere presente nel latte proveniente da animali nutriti con mangimi contaminati da aflatossina B1.Esistono svariati tipi di aflatossine, i principali sono:B1,B2,G1,G2.

I derivati metabolici M1 e M2 Le lettere B e G derivano dalle iniziali delle parole inglesi “blue” (blu) e “green” (verde) che indicano il tipo di fluorescenza emesso da tali sostanze quando sono sottoposte a luce ultravioletta di 360 nm. La lettera M, invece, è l'iniziale della parola inglese “milk”, cioè latte, dove originariamente fu identificata la sostanza.

TLC+UV

La cromatografia su strato sottile o TLC (Thin layer chromatography) è tecnica cromatografica che può essere utilizzata per identificare la presenza di tossine negli alimenti. Il principio su cui si basa è la separazione delle sostanze che si muovono tra una fase stazionaria e una fase mobile. La fase stazionaria è costituita da materiali di diverso tipo (solidi attivi, liquidi supportati su particelle solide inerti, cellulose modificate scambiatrici di ioni) stratificati a spessori sottili su superfici piane (lastrine di vetro, fogli di alluminio, fibre di vetro, fogli o lastre di resine) che ne costituiscono il supportto meccanico. La fase mobile è costituita da un solvente. I meccanismi di separazione dei componenti delle miscele si basano sui fenomeni di: -adsorbimento: se la fase stazionaria è costituita da un solido granulare attivo (dotato cioè della capacità di formare sulla superficie dei granuli legami chimici secondari con le molecole dei componenti le miscele). -ripartizione: se la fase stazionaria è un liquido fissato su un supporto solido granulare, possibilmente del tutto inerte. -scambio ionico: se la fase stazionaria ha la capacità di scambiare ioni.

Fasi stazionarie solide (adsorbimento) Si usano materiali granulari a granulometria regolare e controllata, dotati di forti capacità adsorbenti quali: -gel di silice: acido silicico amorfo polimerizzato, poroso; presenta molti gruppi -OH liberi come gruppi funzionali attivi. -allumina (neutra, basica, acida): si ottiene con tecniche diverse da idrossido di alluminio disidratato ad alta temperatura; può presentare diversi gradi di attività a seconda delle percentuali di acqua residue, presenti nel materiale. Le diverse attività sono classificate secondo una scala che va da I a V nel senso delle capacità di adsorbimento decrescenti.

Fasi stazionarie liquide (ripartizione) Possono essere: -acqua: è normalmente presente in discrete percentuali, nella cellulosa che è quindi un materiale idoneo alla TLC di ripartizione -liquidi lipofili supportati su cellulosa, kieselguhr: paraffine > C 12, oli minerali, oli al silicone

Fasi mobili Sono in genere solventi organici a diversa polarità. Esistono in letteratura degli elenchi di solventi organici utilizzabili come fasi mobili, scelti da vari autori e disposti in ordine di serie eluotropiche (polarità crescente).

Apparecchiature La corsa cromatografica avviene con l'ausilio di una delle seguenti apparecchiature: -camere di sviluppo: sono in vetro, di dimensioni e formati diversi, munite di coperchi a tenuta. Alla loro base vengono versati gli eluenti (solventi puri o miscele di solventi). Le lastrine di vetro su cui è stratificato lo strato sottile di fase stazionaria, “pescano” nell’eluente, che sale attraverso di esse per capillarità (tecnica ascendente). Le camere devono essere a tenuta perchè l’ambiente deve risultare saturo dei vapori dell’eluente; in un ambiente non saturo, il solvente non salirebbe infatti attraverso la lastrina oltre una certa altezza perchè si stabilirebbe un equilibrio tra liquido che sale per capillarità ed eluente che evapora. -stratificatore: apparecchiatura su cui si dispongono le lastrine di vetro lavate e sgrassate. Si fa scorrere su esse (manualmente o automaticamente) una vaschetta contenente una sospensione della fase stazionaria in acqua. Al materiale costituente la fase stazionaria, contenente generalmente anche CaSO4 come legante, per farla aderire alle lastrine, si possono aggiungere, nel preparare la sospensione, degli indicatori di fluorescenza (F254 e/o F366). Questi indicatori consentono, irradiando le lastrine al buio con lampade di Wood che emettono nelle zone 254 e 366 nm, di vedere le sostanze non colorate presenti su di esse, scure sullo sfondo luminoso fluorescente della lastrina attivata. La vaschetta, scorrendo sulle lastrine, lascia dietro di sè uno strato di fase stazionaria di spessore regolabile. Dopo la stratificazione le lastrine si essiccano prima all’aria e poi si attivano in stufa. Oggi sono disponibili in commercio lastrine già pronte del tipo “usa e getta” confezionate con le fasi stazionarie più importanti; esse hanno uno spessore di strato e una granulometria controllati e quindi presentano una maggiore efficienza e migliore riproducibilità di risultati.

Cenni sull’analisi qualitativa e quantitativa in TLC

Analisi qualitativa Per l'analisi quantitativa delle componenti separate si utilizza frequentemente uno standard che viene fatto migrare sulla stessa lastrina, in parallelo con la miscela. Sostanze che migrano alla stessa altezza e che assumono la stessa colorazione con rivelatori specifici, possono ritenersi ragionevolmente uguali. In alternativa, la banda localizzata mediante lampada UV può essere asportata insieme alla fase stazionaria, ed eluita con un solvente per la successiva identificazione mediante l'ausilio di altre tecniche analitiche come IR, UV, GC, HPLC, MS.

Analisi quantitativa L’analisi quantitativa in TLC non offre un’accuratezza ed una riproducibilità elevate. Tuttavia i metodi più accurati ed affidabili sono: -la determinazione dell’intensità delle colorazioni delle macchie mediante una misura delle loro riflettanze con un fotodensitometro a scansione. -la localizzazione delle macchie mediante UV e indicatori di fluorescenza oppure con la tecnica della doppia semina; le macchie vengono quindi asportate insieme alla fase stazionaria, eluite con un solvente e dosate per via strumentale (spettrofotometria, GC, ecc.)

Tecniche operative Le fasi in cui si articola una normale cromatografia TLC, sono: a) semina dei campioni su una linea di partenza b) eluizione o sviluppo del cromatogramma c) rivelazione del cromatogramma

semina dei campioni: si traccia con una matita sulla lastrina, una linea di base o linea di partenza, parallela al lato a 2-3 cm da esso. Con un capillare, una micropipetta o una microsiringa, si seminano i campioni da separare come macchie, avendo cura che non si allarghino troppo, lungo la linea di base, insieme ad eventuali standard di confronto. Si può seminare anche un campione (in questo caso cioè una sola miscela) come una banda deposta lungo tutta la linea di partenza.

sviluppo del cromatogramma:

si immerge la lastrina nell’eluente (fase mobile) posto alla base della camera di sviluppo e si chiude il coperchio a tenuta; l’eluente sale attraverso la lastrina per capillarità (sviluppo ascendente), trasportando con sè le macchie (o la banda). Il trasporto è selettivo perchè, a causa delle diverse polarità dei componenti la miscela, questi risultano più o meno affini alla fase stazionaria. I componenti più affini (adsorbiti più fortemente sulla fase stazionaria solida o più solubili nella fase stazionaria se liquida) restano indietro perchè maggiormente trattenuti dalla fase stazionaria; i meno affini ad essa vengono invece trasportati dall’eluente, più in alto. L’eluente viene fatto migrare per un certo tratto (di solito 15-16 cm) per lastrine di dimensioni 20x20cm, quindi si segna con una matita la linea cui è arrivato (fronte del solvente) e si toglie la lastrina dalla camera di sviluppo.

rivelazione del cromatogramma:

La rivelazione del cromatogramma può essere fatta in due modi : -rivelazione con sistemi non distruttivi: le lastrine, con fasi stazionarie addizionate di indicatori di fluorescenza sensibili alle radiazioni UV comprese in un certo range di lunghezze d’onda, vengono irradiate con lampade che emettono in una banda intorno a 254 nm e 366 nm. Osservate al buio, esse presentano una fluorescenza verde che lascia vedere la posizione delle macchie o delle bande (scure in campo chiaro). Esse si possono circoscrivere con una matita e quindi si può eventualmente asportare la fase stazionaria dalla lastrina grattando con una spatola. -rivelazione chimica (distruttiva): le lastrine vengono spruzzate con soluzioni di reattivi che reagiscono con i componenti sviluppando, a temperatura ambiente o a caldo, delle macchie colorate che individuano i diversi componenti della miscela e gli standard di confronto. I rivelatori chimici si possono distinguere in “universali”, di uso generale e capaci di rivelare qualunque composto, e “specifici” che reagiscono solo con determinate classi di composti (es. ninidrina per gli amminoacidi, SbCl3 in cloroformio per terpeni, steroidi ecc.

Prestazioni

I principali parametri utilizzati por la valutazione delle prestazioni di una TLC sono: -selettività; -efficienza; -riproducibilità.

selettività: si evidenzia mediante la corsa relativa delle diverse macchie (componenti) lungo la lastrina. Si misura numericamente per ogni componente con il fattore di ritenzione Rf(ratio front). Esso è un parametro (Rf assoluto) definito come : Rf= ha\hs hS= distanza percorsa dall’eluente dalla linea di partenza al fronte del solvente hA= distanza percorsa dalla macchia del componente A

Si ha naturalmente maggiore selettività quando i valori di Rf rilevati, risultano molto diversi tra loro.

efficienza: capacità delle macchie dei singoli componenti, di migrare compatte senza diffondere nella fase stazionaria (allargandosi e deformandosi).

omogeneità nell’impaccamento dello strato riproducibilità: essa è la prestazione maggiormente richiesta. A parità di tutti gli altri fattori da cui dipende una TLC, è garantita da: -riproducibilità degli spessori dello strato sottile; -temperatura di sviluppo (cambiano i coefficienti di adsorbimento e di ripartizione); -quantità di miscela seminata.

OCCORRENTE

  • disco di carta assorbente;
  • piastre di Petri sterili da 9 cm;
  • 8 g di mais macinato;
  • acqua distillata;
  • 500 μL di sospensione conidica (10^6 sp/mL);
  • termostato;
  • bilancia tecnica;
  • Etil-acetato;
  • Isopropanolo;
  • vortex;
  • centrifuga;
  • pipette;
  • propipette;
  • eppendorf;
  • micropipetta;
  • lastrina per TLC;
  • Etanolo;
  • Acetone;
  • trans-illuminatore e lampada UV;
  • spatole;

PROCEDIMENTO

Inoculo dello sfarinato con i ceppi fungini

  • posizionare un disco di carta assorbente sul fondo delle Piastre di Petri sterili da 9 cm;
  • aggiungere 8g di mais macinato;
  • bagnare il mais con 5 mL di acqua sterile;
  • aggiungere 500 μL di una sospensione conidica (10^6 so/mL). Gli ascomiceti utilizzati per l'esperimento sono i seguenti: Aspergillus Flavus, Aspergillus carbonarius e Fusarium verticillioides;
  • lasciar crescere per 7 giorni in un termostato al buio a 25° C.

Campioni:

Estrazione di tossine e visualizzazione della Aflatossina B1 trammite TLC+UV

  • pesare 250 mg di mais inoculato con Aspergillus Flavus in eppendorf da 2 ml o falcon da 15 ml; NB: nel caso in cui si analizzi un prodotto alimentare sopra indicato, bisogna in precedenza polverizzarlo con l'ausilio di un mortaio;

  • aggiungere 1 mL contenente Etil-acetato : Isopropanolo : acqua nel rapporto 3 : 1 : 1 (aggiungere 600 μL di Etil-acetato e vortexare per 1 minuto; 200 μL di isopropanolo e vortexare per 1 minuto; aggiungere 200 μL di acqua e vortexare per 1 minuto);
  • vortexare;

  • lasciare in agitazione per 5 minuti;
  • centrifugare per 10 minuti a 7000 rpm o lasciare 15 minuti a temperatura ambiente per far separare le fasi;

  • recuperare la fase superiore;
  • preparare la lastrina: tracciare una linea ad 1 cm da fondo lasciando 1 cm a destra ed 1 cm a sinistra; tracciare i punti ad 1,5 cm di distanza l'uno dall'altro;
  • caricare 50 μL di estratto ( 25 μ alla volta intervallati da asciugatura) e 1 μL di standard AFLAB1 su TLC;

  • immergere la lastrina nella fase mobile composta da Etanolo : Acetone con un rapporto di 22 : 3;

  • visualizzare con Trans-illuminatore o con lampada UV l'AFLAB1.

Alfatossina B1 su mais. Ricerca di aflatossina B1 in prodotti alimentari confezionati.

OSSERVAZIONE E CONCLUSIONE

L'aflatossina B1 è visualizzabile sotto radiazioni UV-visibile con lunghezza d'onda di 463nm. Nel caso dell'esperienza 1, in cui avevamo una contaminazione vera e propria da Aspergiullus flavus, tutti i campioni di mais contaminati dal fungo hanno mostrato un segnale di fluorescenza compatibile con la presenza di aflatossina B1. Nel caso dell'esperienza 2, in cui avevamo alimenti potenzialmente contaminati, senza conoscere a priori la tipologia di fungo eventualmente presente, non è stata osservata la presenza di aflatossina B1. Infatti, l'unico segnale di fluorescenza osservato è stato quello relativo allo standard di AFLAB1 a dimostrare che tutti i campioni alimentari analizzati erano privi di l'aflatossina B1.

biologia/esperienze/ricerca_delle_aflatossine_nei_cereali_e_derivati.txt · Ultima modifica: 2019/09/23 14:30 (modifica esterna)