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biologia:esperienze:micotossine_e_analisi

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Micotossine negli alimenti,analisi sulle micotossine e normativa Europea

DEFINIZIONE

Le micotossine sono composti tossici prodotti da diversi tipi di funghi microscopici filamentosi, appartenenti principalmente ai generi Aspergillus, Penicillium e Fusarium, e lieviti che proliferano e si sviluppano con formazioni pulverulente (muffe) bianche, verdastre o nere sulle coltivazioni sia in campo, a causa di particolari condizioni ambientali, quali eccessiva temperatura e umidità, sia durante il trasporto e lo stoccaggio in seguito ad una conservazione o ad un trattamento impropri. Generalmente entrano nella filiera alimentare attraverso colture contaminate destinate alla produzione di alimenti e mangimi, principalmente di cereali. Le micotossine sono tra i contaminanti più pericolosi per la salute dell’uomo; le muffe tossigene sono praticamente ubiquitarie, possono cioè vivere in molti tipi di ambienti, adattandosi bene alle diverse temperature anche se preferiscono il caldo e in presenza di un tenore di umidità elevata.

PRINCIPALI MICOTOSSINE NEGLI ALIMENTI

Aflatossine

Si sviluppano da due specie di funghi, l’Aspergillus flavus e A. parasiticus . Anche se non scatenano intossicazioni acute, esponendo l’organismo per lunghi periodi alla loro azione possono dar luogo a patologie serie a carico del sistema immunitario e nervoso, dei polmoni, del fegato. I prodotti sotto accusa nel mondo vegetale sono: cereali, semi oleaginosi, frutta secca (arachidi, noci, mandorle, pistacchi, fichi secchi) spezie, succhi di mela (aflatossine B1, B2, G1, G2). Nel mondo animale: latte e formaggio se provengono da bestiame alimentato con foraggi che presentano considerevoli livelli di micotossine (aflatossine M1)

Ocratossina A

E’ una tossina che viene prodotta da funghi appartenenti a diversi generi, Aspergillus ochraceus, A. carbonarius e Penicillium verrucosum. Compare più frequentemente in cereali, legumi, caffè, semi di cacao, carni suine. È possibile un ruolo nefrotossico (a carico dei reni).

Tricoteceni

Sono un gruppo di micotossine prodotte da diversi generi di funghi, tra i quali Fusarium, Cephalosporium,Myrothecium, Trichoderma, Trichothecium, Verticimonosporium e Stachybotrys. Ne fanno parte numerose sostanze, assai simili tra loro. Una delle più importanti è la vomitossina, rintracciabile soprattutto in cereali e foraggi non sottoposti dopo la raccolta a essiccamento e stoccaggio adeguati. Patologie a carico della pelle e delle mucose.

Patulina,Griseofulvina,Acido ciclopiazonico e Roouffortina C.

Sono micotossine che possono essere prodotte da una singola specie fungina, Penicillium griseofulvum. Possono essere presenti in succhi di mela, frutta (mele e pere) conservate male e loro trasformati (sciroppo, marmellate, consna serva, ecc. ). Possono essere tossiche per fegato, reni e polmoni.

CONSEGUENZE DELLE MICOTOSSINE SULLA SALUTE

Le micotossine sono molecole piccole, con struttura chimica molto diversa tra di loro, definite come “sostanze naturali prodotte da funghi, in grado di provocare una risposta tossica quando introdotte per vie naturali in vertebrati e altri animali“. Ad oggi sono state isolate oltre 300 diverse micotossine ma soltanto alcune di queste rappresentano un problema per la salute. Le più importanti sono aflatossine, ocratossine, fumonisine, tricoteceni, zearalenoni e patulina. Le aflatossine possono causare una intossicazione acuta, di solito mortale negli animali, oppure un’intossicazione cronica che può causare cancro, immunosoppressione, mutazioni e malformazioni fetali. Le aflatossine attaccano il DNA e le proteine del nucleo, determinando gravi alterazioni, mutazioni e perdita di funzionalità. L’organo bersaglio è il fegato e infatti l’aflatossina B1 è classificata come un cancerogeno del gruppo 1 per il carcinoma epatico, uno dei più potenti carcinogeni noti, mentre l’aflatossina M1 è classificata nel gruppo 2A. Il problema della contaminazione da aflatossina è molto grave nei paesi in via di sviluppo, nei quali l’incidenza di cancro del fegato è in effetti da 2 a 10 volte superiore rispetto a quanto si osserva nei paesi industrializzati. Di maggior importanza per la salute è l’ocratossina A che troviamo in cereali e derivati, in legumi e caffè e anche in alcune uve, contaminate da Aspergillus carbonarius. Caffè e vino sono in effetti gli alimenti che apportano la maggior quantità di ocratossina A. Si tratta di una sostanza che lo IARC ha classificato come potenzialmente cancerogena (gruppo 2B), in grado di inibire la sintesi proteica, con una apprezzabile attività immunosoppressiva. L’ocratossina A si accumula nel rene e può dare nefrotossicità: si pensa che possa essere una delle cause della Nefropatia endemica balcanica, una malattia del rene molto diffusa nell’area dei Balcani. Le fumonisine interferiscono con il metabolismo degli sfingolipidi, sostanze essenziali per l’integrità strutturale delle membrane, con la maggior parte dei danni prodotti a livello di rene e fegato. Lo IARC le classifica come probabilmente cancerogene per l’uomo (gruppo 2B). La presenza di un elevato contenuto di fumonisine è correlato ad una incidenza più elevata di cancro all’esofago in Sudafrica, China e nel nord-est dell’Italia. I tricoteceni interferiscono con i processi di sintesi proteica e con duplicazione trascrizione di DNA e RNA. Il consumo di prodotti contaminati può provocare nausea, vomito e dolori addominali. Consumo elevato di cereali ammuffiti, contenenti rilevanti quantità di tossina-T2, può causare Leucopenia tossica alimentare, una malattia mortale nell’80% dei casi, descritta in alcune comunità russe durante la seconda guerra mondiale. I tricoteceni non risultano cancerogeni per l’uomo. Gli zaearalenoni non sono tossici per l’uomo nelle quantità riscontrate nei prodotti alimentari, si tratta tuttavia di sostanze potenzialmente problematiche per la loro struttura simile a quella degli estrogeni e quindi per la loro attività anabolica e per la capacità di alterare i normali equilibri ormonali anche in concentrazioni ridotte, effetto molto evidente sugli animali d’allevamento. Più che di micotossine si dovrebbe parlare di micoestrogeni, anche se non è ancora chiaro in che misura queste sostanze possano contribuire al carico di xenoestrogeni, i cosiddetti interferenti endocrini, che negli ultimi anni sono sempre più indagati per i potenziali problemi che potrebbero creare negli animali e nell’uomo. Attualmente, per mancanza di dati, lo IARC classifica gli zearalenoni tra le sostanze non cancerogene. Patulina è una tossina prodotta da diverse specie di Aspergillus e Penicillium. Dapprima studiata per essere utilizzata come antibiotico è stata subito classificata come micotossina non appena ne è stata evidenziata la tossicità per gli animali e l’uomo. Le muffe che la producono, soprattutto Penicillium expansum, sono tipiche della frutta e in particolar modo della mela. La patulina si trova spesso nei succhi di mela ma non nel sidro visto che viene distrutta dai processi fermentativi. Nonostante la ridotta tossicità WHO e FAO hanno indicato una dose massima giornaliera tollerabile di 0,4 μg/kg peso corporeo, con consumi medi nella popolazione decisamente al di sotto dei valori soglia. In Europa sono indicati dei tenori massimi di patulina diversi per i succhi di frutta destinati al consumo generale, 50 μg/kg prodotto, e per i succhi destinati all’alimentazione per l’infanzia, 10 μg/kg prodotto.

PREVENZIONE SULLA CONTAMINAZIONE DA MICOTOSSINE NEGLI ALIMENTI

Quasi tutti i prodotti vegetali possono essere substrato per la crescita di funghi produttori di tossine e non è raro trovare micotossine in alimenti destinati al consumo umano o in mangimi. Difficile controllarne crescita e sviluppo sul campo perché di anno in anno la contaminazione può variare in funzione del clima e di altri fattori ambientali. Di sicuro risulta più facile ridurre le possibili contaminazioni nella fase post-raccolta e durante lo stoccaggio, momenti nei quali è possibile controllare quei parametri — temperatura, umidità, attività dell’acqua e tensione di ossigeno — che possono impedire la crescita dei funghi. Un dato da tenere sempre presente è che non sempre le muffe producono tossine e quindi la crescita di funghi delle specie incriminate non sempre comporta la presenza di questi composti, presenza che può essere rilevata soltanto con tecniche analitiche specifiche ed estremamente sensibili. Il problema è complicato dal fatto che le micotossine sono molto stabili e difficili da eliminare con i processi fisici e biologici impiegati dall’industria alimentare. Anche bevande fermentate come vino e birra possono contenere micotossine, in alcuni casi in quantità potenzialmente problematiche, specie per quel che riguarda le birre, ottenute da orzo e altri cereali, più di frequente attaccati dalle muffe. L’eliminazione completa delle micotossine non è un obiettivo realistico ma di certo bisogna lavorare per ridurne al minimo la presenza negli alimenti. La miglior arma resta la prevenzione, con massima cura in ognuna delle fasi della filiera alimentare, dal campo al magazzino. Tra le misure essenziali: impiego di varietà vegetali resistenti al fungo o inadatte alla sintesi di micotossine; pratiche agronomiche mirate che evitino stress alle piante; essiccamento rapido dei prodotti alla raccolta; scrupolosa applicazione dei principi HACCP nella fase post-raccolta; massima igiene durante la produzione degli alimenti e dei mangimi e tecniche di conservazione mirate.

CAMPIONAMENTO MICOTOSSINE

Un corretto campionamento è il presupposto essenziale per un metodo analitico affidabile, tenendo presente che il risultato che si ottiene è sempre riferito al campione esaminato. Tutte le operazioni di campionamento devono essere condotte in condizioni tali da garantire la sicurezza degli operatori e la protezione del campione da eventuali contaminazioni esterne. Si distinguono due tipi di campionamento:

  • statico: i prelievi vengono effettuati in punti diversi di una massa stoccata;
  • dinamico: i prelievi vengono effettuati a tempi diversi di una massa in movimento.

Il campionamento statico richiede l’impiego di sonde, è di difficile attuazione e l’errore aumenta con l’aumentare delle dimensioni e del tipo di massa stoccata. Il campionamento dinamico è più facile da realizzare, i campioni elementari si prelevano dai nastri trasportatori e si utilizzano campionatori automatici. La frequenza di prelievo dei campioni elementari dipende dalla velocità e dalle dimensioni del flusso e dalle dimensioni del campione totale.

Alimenti secchi e umidi devono essere campionati in modo diverso:

  • Campionamento di alimenti secchi con umidità inferiore al 15% come semi secchi, fieno e concentrati:
  1. prendere 8 – 12 campioni ogni 3-5 partite di merce rimossa dallo stoccaggio,
  2. mescolare bene i sottocampioni e raccogliere un campione di 500 g,
  3. unire 3 – 5 campioni, mescolare e prendere 500 g per il campione finale da inviare al laboratorio,
  4. conservare i campioni in sacchetti di carta a doppio strato, in un luogoasciutto, fino alla consegna al laboratorio.
  5. oppure prendere 12 – 20 campioni sul flusso di materiale di scarico, oppure con una sonda da un contenitore. Prelevare i campioni a diverse profondità e ai lati. I campioni vanno formati mediante prelievi casuali, tenendo conto che le muffe tendono a formarsi nelle parti laterali dei contenitori e sulla sommità,
  6. mescolare i sottocampioni e prelevare il campione finale di 500 g da inviare al laboratorio.
  • Campionamento di alimenti umidi con un’umidità superiore al 15% come semi umidi, silomais:
  1. prendere 8 – 12 campioni ogni 3-5 partite di alimenti rimossi dallo stoccaggio,
  2. mescolare bene i sottocampioni e raccogliere un campione di 1 kg,
  3. unire 3 – 5 campioni, mescolare e prendere 1 kg per il campione finale da inviare al laboratorio,
  4. mettere i campioni in sacchetti di plastica, avendo cura di far uscire l’aria,e conservare in congelatore fino alla consegna al laboratorio.

La determinazione del contenuto in micotossine dipende, oltre che dalla correttezza dell’analisi eseguita in laboratorio, dal campionamento del materiale da esaminare. Negli ultimi anni sono state sviluppate numerose tecniche idonee a queste determinazioni che richiedono l’applicazione di una serie di fasi sequenziali:

  1. estrazione della micotossina dalla matrice utilizzando soluzioni estraenti,

metodi e tempi di miscelazione adeguati alle proprietà chimico-fisiche della micotossina da estrarre e della matrice che la contiene;

  1. purificazione dell’estratto al fine di ridurre o eliminare le sostanze interferenti utilizzando colonnine per estrazione in fase solida (SPE) o di

immunoaffinità (IAC);

  1. separazione e quantificazione delle micotossine mediante tecniche

cromatografiche. La cromatografia liquida (HPLC) è la tecnica attualmente più utilizzata e di riferimento per l’elevata sensibilità e specificità.

IDENTIFICAZIONE MICOTOSSINE CON CROMATOGRAFIA LIQUIDA ED ALTRE TECNICHE.

La cromatografia liquida ( LC dall'inglese liquid cromatography) è un insieme di tecniche analitiche e preparative. Nella cromatografia liquida la fase stazionaria è solida mentre l'eluito e la fase mobile sono liquidi.

Esistono diversi tipi di cromatografia liquida:

  • cromatografia liquida classica, usata quasi esclusivamente per scopi preparativi;
  • cromatografia liquida ad alta prestazione, usata come tecnica analitica;
  • cromatografia liquida a ultra alta prestazione;
  • cromatografia di adsorbimento, basata sull'adsorbimento (liquido-solido);
  • cromatografia a scambio ionico, basata sullo scambio ionico;
  • cromatografia di ripartizione: cromatografia su carta, cromatografia su strato sottile, cromatografia su strato sottile ad alta prestazione, basata sulla ripartizione/setacciamento (liquido-liquido);
  • cromatografia di esclusione molecolare, basata sull'esclusione dimensionale;
  • cromatografia di affinità, basata sull'affinità: ripartizione tra il film liquido superficiale e la fase mobile;
  • cromatografia liquida ad alta temperatura, usata come tecnica analitica.

Solitamente comunque con il termine cromatografia liquida si indicano la cromatografia liquida classica e la cromatografia liquida ad alta prestazione.

La cromatografia su colonna, nota anche come cromatografia liquido-solido o di adsorbimento o a fase normale (acronimo: NP-LC) è basata sull'interazione tra i siti attivi dell'adsorbente solido (generalmente silice) con i gruppi funzionali presenti nelle molecole del soluto da separare.

La cromatografia liquida ad alte prestazioni (High Performance Liquid Chromatography), è un'evoluzione della tecnica cromatografia che permette la separazione di miscele (anche complesse) in pochi minuti. Con essa si effettuano analisi quantitative ma è possibile anche avere informazioni sulla natura chimica delle sostanze analizzate.

La fase mobile:

  • è un liquido a bassa viscosità, requisito necessario per la resa della colonna, facendo sì che i tempi di analisi siano più brevi e ci sia pressione all'ingresso;
  • deve essere immiscibile con la fase stazionaria;
  • possiede la capacità di solubilizzare il campione, senza che risulti torbido;
  • è compatibile con il rivelatore, nel caso venga utilizzato un rifrattometro il solvente deve possedere un indice di rifrazione costante, oppure con un rivelatore UV/visibile deve essere trasparente alla λ analitica;
  • ha bassa corrosività e volatilità;
  • ha minima tossicità;
  • possiede basso costo e deve essere reperibile;
  • deve avere un'elevata purezza, il minimo inquinamento della colonna potrebbe produrre un cromatogramma con interferenze.

L'acqua è un solvente molto usato ma deve essere trattata con dispositivi per ridurre le sostanze organiche e ioniche presenti in quella di grado analitico comune in laboratorio, oppure può essere acquistata già pronta all'uso.

La fase stazionaria, ben impaccata nella colonna, è composta da una struttura a particelle che possono essere pellicolari o porose.

  • Le particelle pellicolari hanno un nucleo non poroso di forma sferica rivestita da uno strato sottile microporoso (spessore 1-3 µm) con un diametro interno di 10-50 µm.

Ad oggi sono utilizzate per precolonne di protezione (guard column).

  • Le particelle porose possono essere di forma sferica che irregolare con diverso grado di porosità e il diametro va da 2 a 10 µm, minore è la granulometria più fine sarà la colonna utilizzata.

Le microparticelle hanno una superficie uniforme e totalmente porosa che fornisce una maggiore efficienza. Permettono un impaccamento regolare e una pearmeabilità fino a due volte di più rispetto alle convenzionali, avendo una capacità più alta le rendono adatte ad analisi prepararive. Di contro sono molto difficili da impaccare e tendono a ringonfiarsi, soprattutto se sono costituite da polimeri. Caratteristiche delle particelle:

  1. FORMA
  2. DIMENSIONE particelle
  3. DIMESIONE pori
  4. AREA SUPERFICIALE
  5. DISTRIBUZIONE E VOLUME PORI

FASI STAZIONARIE PER LSC

Nella cromatografia liquido-solido (Liquid-Solid Chromatography) utilizza fasi stazionarie granulari a varie porosità, generalmente polari e dunque associate a fasi mobili non polari. Il suo impiego è importante a scopi preparativi e per il suo costo basso ma non trova grandi applicazioni perchè una separazione a fase normale è meglio con una fase stazionaria legata chimicamente al supporto. Il gel di silice consente di ottenere particelle porose, resistenti meccanicamente e più o meno uniformi e perciò è il materiale più usato. Ha proprietà acide percui trattiene composti basici. I suoi siti attivi offrono interazioni forti con le sostanze eluite possono causare fenomeni di tailing o di adsorbimento chimico causando difficoltà nella rigenerazione della colonna. Per evitarlo si utilizzano gel di silice a media o bassa polarità, per composti non polari si utilizza il gel di silice a media o alta polarità. L'allumina vendo caratteristiche basiche è un'alternativa al gel di silice nel caso si separazioni insoddisfacenti.

FASI STAZIONARIE LEGATE

Nella cromatografia a fase legata, la fase stazionaria è legata chimicamente al supporto solido tramite superficie e all'interno dei pori creando un tutt'uno stabile. Per realizzare le fasi legate si inseriscono gruppi funzionali. Nel caso del gel di silice i gruppi -OH posti sulla superficie vengono fatti reagire con dimetil- alchil-clorosilano (ottenendo materiali di tipo monomerico) o dialchil-clorosilano (per strati polimerici con spessore variabile). A seconda della natura dei gruppi funzionali legati alla silice, la fase stazionaria può essere :

  • polare, richiede una fase mobile non polare per una cromatografia normale su fase legata (BPC-NP)
  • non polare, associata a una fase mobile polare per una cromatografia inversa su fase legata (BPC-RP)

Strumentazione: CROMATOGRAFO per HPLC.

  • SERBATOIO eluente (contiene la fase mobile)
  • POMPA e MISCELATORE (se sono 2 miscele)
  • Regolazione di flusso
  • INIETTORE
  • precolonna, COLONNA
  • RIVELATORE
  • RACCOGLITORE (può essere uno spettrofotometro)
  • RACCOGLITORE e MICROPROCESSORE

POMPE

Il requisito più importante è fornire un flusso cosatante e riproducibile. Una pompa meccanica per HPLC è formata da un pisone pulsante che produce 70, in condizioni di massimo sforzo, 70 pulsazioni al minuto. Ha un'autonomia illimitata, lavora in gradiente ed è facile da pulire. Di contro ogni volta che il pistone ritoma alla posizione di partenza si verifica un calo di pressione, perciò non si può ottenere una pressione costante a causa delle pulsazioni. Questo problema è stato risolto con le pompe reciprocanti a due pistoni: mentre uno si trova in fase di scarica dell'eluente l'altro si trova in fase di ricarica. Ma sono stati anche applicati sistema di smorzamento a spirale o a membrana che consentono di mantenere una pressione di alimentazione costante.

SISTEMI DI INIEZIONE

Per iniettare il campione si ricorre ad un sistema di iniezione dotato di un iniettore a 2 posizioni. Nella fase di caricamento del campione, la fase mobile aspirata dalla pompa viene inviata direttamente nella colonna, mentre il campione attraverso una siringa viene immesso attraverso un tubicino a spirale chiamato loop prima di andare allo scarico. Spostando l'interruttore nella seconda posizione il circuito del campione è isolato (non c'è la siringa), mentre l'eluente spinto dalla fase mobile trascina il campione, contenuto del loop, verso la colonna.

COLONNE

Le colonne per HPLC posso essere in acciaio in in vetro borosilicato, le prime a volte tendono decomporre il campione percò si prediliggono quelle in vetro con pareti molto spesse resistenti alle elevate pressioni di esercizione. Nonostante il materiale è importante che le superfici interne siano speculari per elimanare gli effetti parete e le imperfezioni devono essere nello stesso ordine di grandezza del daimetro delle particelle della fase stazionaria. La lunghezza delle colonne va da 3 (ma anche 1) a 25 cm e il diametro interno, proporzionale alla lunghezza della colonna, va da 1 a 10 mm. I diametri piccoli forniscono valori elevati di efficenza, ma creando problemi d'impaccamento potrebbero fornire un'efficenza più bassa del previsto. La scelta delle dimensioni della colonna variano a seconda del tipo di fase stazionaria a dalla sua granulometria. Per i materiali pellicolari sono utilizzante colonne lunghe e sottili, le microparticelle invece, che in colonne del genere presenterebbero difficoltà nell'impaccamento, necessitano di colonne corte e con un diametro notevole. La colonna più in uso ha un diametro interno di 4,6 mm, una lunghezza di 25 cm e il riempimento ha una granulometria di 5 µm.

RIVELATORE

IL rivelatore fornisce indicazioni sulla presenza e quantità di igni comonente in uscita dalla colonna. Si trova a valle della colonna in una cella di flusso. Non è possibile adottare un rivelatore universale con caratteristiche di sensibilità tali da essere utilizzato per qualsiasi separazione. Ogni tipo di rivelatore possiede prestazione e caratteristiche giudicate facendo riferimento a parametri:

  • selettività
  • sensibilità
  • tempo di risposta
  • stabilità
  • rumore di fondo
  • range lineare di risposta
  • limite di rivelabilità

Ma anche il volume della camera di rivelazione deve avere un valore piccolo tra 20-30µm (8-13 µm rivelatori ottici o 1 µm per applicazioni speciali). Deve mantenere le sostanze in uscita sufficientemente compatte per evitare che l'ampiezza di banda strumentale incida sull'efficienza di separazione. Un buon rivelatore è robusto, manegevole, pratico, poco costoso ma soprattutto riproducibile.

Secondo il funzionamento, i rivelatori per HPLC, possono essere suddivisi in due grandi categorie:

  1. quelli che misurano una caratteristica tipica, dotati di buona sensibilità e selittività. Non sono distruttivi e resistono alle variazioni di temperatura.
  2. quelli che misurano piccole variazioni di una determinata caratteristica fisica dell'eluente in uscita grazie ai componenti della miscela, sono poco sensibili e hanno un utilizzo pressocchè universale, necessitano di essere termostatati perchè sensibili alle variazioni di temperatura.

Il rivelatore spettrofotometrico UV/visibile è il più utilizzato in HPLC perchè, soprattutto nel campo della chimica organica, molte molecole grazie alla configurazione elettronica dei gruppi funzionali o degli anelli aromatici, sono in grado di assorbire radiazioni nel campo dell'UV/visibile. Ma le molecole possono assorbire in questa regione spettrale comunque se modificate con reagenti cromogeni. Oltre che per la loro quasi universarlità d'impiego, sono i prediletti grazie alla stabilità alle variazioni di temperatura e di flusso ma anche perchè posso essere utilizzati per eluizioni in gradiente. il limiti di rivelabiltà sono molto bassi (100-1000 pg). I solventi scelti non devono assorbire alla lunghezza d'onda del rivelatore, anche se potrebbe capitare e produrre segnali causati dalla diffusione delle luce riflessa sulle pareti della microcella o per turbolenze, capita maggiormente in gradiente.

NORMATIVA (CE) MICOTOSSINE NEGLI ALIMENTI

biologia/esperienze/micotossine_e_analisi.txt · Ultima modifica: 2019/09/23 14:30 (modifica esterna)